About MOP

1 Mouse One Portal

2 마우스 유전자 변형

인간유전자의 기능을 확인하는 가장 강력한 방법은 인간 상동 유전자가 결손 혹은 변형된 모델생물의 생체 변화, 즉 생물학적 특성 변화, 표현형을 확인하는 방법임
마우스를 이용하여 유전자의 기능을 파악하는 방법에는 크게 두 가지로 나누어 볼 수 있는데, 인위적으로 특정 유전자 mutation을 유발하고 그에 따른 표현형을 관찰하여 유전자 기능을 파악하는 역방향 접근법(reverse approach or genetics)과 표현형에 이상을 보이는 유전자변형생물체를 확인하고 그 표현형을 유발하는 유전자 돌연변이(mutation)를 확인하는 정방향 접근법(forward approach or genetics)로 나누어짐

< 역방향 접근과 정방향 접근 >

3 Gene targeting strategy of IKMC

1. KOMP-CSD와 EUCOMM에서 사용되는 targeting strategy

• Knockout-first allele:
  Promoterless & promoter driven targeting cassette

  • KOMP-CSD와 EUCOMM에서는 가장 많이 사용하는 방법은 “promoterless targeting cassette”와 “promoter-driven targeting cassette”를 사용하는 것임.
  • Drug-resistant 유전자 발현 방법에 따라 “promoterless targeting cassette”와 “promoter-driven targeting cassette”이 구별됨.
  • CSD team = 미국과 영국에서 KOMP/IKMC project를 공동 진행하는 연구팀 약자(Children's Hospital Oakland Research Institute + University of California at Davis + Wellcome Trust Sanger Institute)
  • Homologous 재조합 (recombination)에 의해 벡터가 표적 유전자에 삽입된 targeted allele는 “tm1a”임.
  • Cre/loxP 재조합에 의해 critical exon이 결손(deletion) 되면 “tm1b” allele가 됨. 결과적으로 “tm1b” allele는 conventional knockout allele임.
  • Flp/FRT recombination에 의해 lacZ-neo cassette가 결손되면 “tm1c” allele가 됨. “tm1c” allele는 conditional knockout allele임.
  • “tm1c” allele에서 Cre/loxP 재조합이 되면, “tm1d” allele가 만들어짐. ”tm1d” allele는 translational stop에 의해 정상적인 단백질이 만들어지지 않을 가능성이 높기 때문에 conventional knockout allele와 같음.
  

• Targeted, non-conditional allele

  • Homologous 재조합 과정에서 세 번째 loxP가 염색체에 삽입되지 않으면, 결과적으로 아래 그림과 같은 “targeted, non-conditional allele”가 만들어짐 (“tm1e”).
  • “tm1e” allele는 lacZ-neo cassette에 존재하는 transcripiton stop (polyA) 때문에, conventional knockout allele와 같음.
  

• Targeted deletion

  • Critical exon 위치에 drug-resistant cassette가 삽입되면 “tm1” allele가 만들어짐.
  • 전통적인 방식의 conventional gene-targeting과 같은 방식임.
  • “tm1.1”은 lacZ reporter 마우스로 활용할 수 있음.
  • “tm1.2”는 ”tm1d”와 같음.
  

• Knockout-first allele: Artificial intron

  • 표적 유전자(target gene)의 exon의 수가 적거나, critical exon이 5‘ 쪽에 존재하지 않으면, gene-targeting이 불가능하게 됨.
  • 이런 경우, 하나의 exon을 쪼개고 인위적으로 intron을 집어넣는 방법을 사용함 (artificial intron).
  • 아래 그림과 같은 exon1을 exon1a, exon1b로 나누고, loxP sequence를 exon1b 양쪽에 삽입하면, "tm1a" allele를 만들 수 있게 됨.
  

• KOMP-Regeneron에서 사용되는 vector construct

  • Regeneron, Inc.의 VelociGene group에서 사용하는 벡터
  • 이 벡터를 사용하면 complete null allele가 만들어짐.
  

4 ENU mutagenesis

• 마우스에서 인위적인 유전적 돌연변이 유발법

  유전자의 돌연변이를 유도하는 방법으로는 유전자 도입법, 유전자 적중법, X-선 또는 UV 조사법, 화학물질 투여법 등과 같은 방법이 이용되어져 왔으며, 그 중에서 강력한 독성 물질이자 생식세포에 점 돌연변이(point mutation)를 일으키는 것으로 알려진 N-ethyl-N-nitrosourea (ENU)를 이용한 무작위 돌연변이 생성법(random mutagenesis)이 널리 사용되어지고 있음.

• ENU 활용 마우스 유전자 변형

  ENU의 ethyl group은 DNA의 산소원자 또는 질소원자와 결합하여 DNA 부가 생성물을 생산하고 DNA 수선(repair)이 이루어지지 않게 하며, 새로운 염기쌍으로 치환되어 점 돌연변이(point mutation)을 일으키고, 체세포뿐 아니라 특히 수컷 마우스의 정원 세포에 작용하여 점 돌연변이(point mutation)를 유발시켜 다양한 돌연변이체를 얻을 수 있는 장점이 있음.

• ENU 유전자 변형 마우스 모델의 활용

  ENU를 통한 유전자기능 연구는 다양한 돌연변이라인들을 구축하기 위해 방대한 사육시설과 표현형 분석 플렛폼 그리고 인력이 필요한 단점이 있으나, 특정 질환에 대해 새로운 유전자를 밝히고 그 기능을 분석하기 위해서는 매우 효과적인 방법이라고 할 수 있음. 또한 최근 유전체염기서열분석법의 비약적인 발전으로 인해 ENU에 의해 mutation이 유발된 부위를 과거에 비해 훨씬 쉽게 확인할 수 있다는 점도 ENU를 이용한 연구를 활성화시키는데 한몫을 하고 있음

5 자연발증 돌연변이 (Spontaneous Mutation)

1970년대 유전자 재조합기술의 개발이후 유전자변형마우스 (Genetically Engineered Mouse) 모델의 제작이 가능해져 다양한 질환모델동물의 제작이 가능해졌음. 그러나 이러한 분자생물학적 기법 개발되기 전에도 다양한 모델동물의 사용이 가능했었는데, 그것은 마우스의 교배과정 중 자연적으로 발생하는 자연돌연변이(spontaneous mutation) 또는 ENU와 같은 강력한 돌연변이 유발물질의 투여에 의한 의도적인 유도돌연변이 (induced mutation) 등에 의해 질병과 관련된 표현형을 나타내는 마우스들이 발견되었기 때문임.
사람을 포함한 대부분의 포유류에서 발생하는 대부분의 유전적 질환은 특정한 하나의 유전자 이상과 관련된 경우가 많음. 마우스 교배과정에서 특정 유전자의 자연돌연변이로 표현형에 이상을 유발하게 되고 이러한 특징적인 표현형은 사람의 질환모델로 널리 활용되어 왔음. 대부분이 monogenic mutation이며 recessive 혹은 dominant 유전양식을 보임.
코딩 단백질 이름과 돌연변이 증세(표현형)를 같이 유전 기호로 사용함.
식이중추를 조절하는 leptin 유전자가 돌연변이 된 경우의 표현형(윗 첨자로 표시))이 obese (비만)이다. Lep(obese)로 유전자가 표현됨. 자연돌연변이 마우스에 대한 연구로 사람의 질병과 관련된 새로운 유전자를 발견하게 되는 경우도 있고 기존 유전자의 새로운 기능을 확인하기도 함. 이러한 자연돌연변이 마우스 모델에는 다양한 모델들이 있음.

6 유전자변형마우스 관련 글로벌 컨소시움

1. 국제 마우스 자원 컨소시움 IKMC
(International Knock-out Mouse Consortium)

• 세계 주요국은 2008년 GEM 컨소시엄을 구성하여 국제공동프로젝트를 진행하여 연구 성과를 공유하고 GEM을 통한 유전자 기능해석 및 특허확보 경쟁을 가속화 하고 있음
• IKMC는 기존 KOMP, NorCOMM, EUCOMM의 연합으로 2004년부터 2010년까지 생산된 GEM제작 정보를 공유하는 1세대 글로벌 GEM 컨소시움임
• IKMC는 미국, 캐나다, 유럽 중심의 컨소시움으로 GEM 대량생산과 기본 분석 플랫폼 표준화를 목표로 2008년 설립됨
• IKMC는 GEM제작 공유 및 각 가입 기관별 관리 유통을 수행하고 있으며 24,645개의 ES cell lines중 15,586개의 단백질을 코딩함
• 미국 중심의 KOMP와 TIGM 캐나다 중심의 NorCOMM, 유럽중심의 EUCOMM의 연합 컨소시엄으로 GEM 생산 및 표현형분석연구의 선도적 역할을 수행중
  • - KOMP : Knockout Mouse Project
  • - NorCOMM : North American Conditional Mouse Mutagenesis project
  • - EuCOMM : European Conditional Mouse Mutagenesis project
  • - TIGM : Texas A&M Institute for Genomic Medicine

2. IMPC (International Mouse Phenotyping Consortium)

• IMPC는 GEM제작 결과 생산된 GEM의 특성을 분석하여 인간 유전자의 기능을 연구하기 위해 설립된 마우스 표현형분석을 공유 국제 컨소시엄임
• PhaseⅠ(‘11~‘16년)과 PhaseⅡ(‘16~‘21년)의 각각 5년의 기간 동안 1단계 4,000라인과 2단계 12,750마우스 라인에 대하여 표현형분석 실시예정
• GEM의 phenotype 정보를 제공하고 궁극적으로 포유류의 유전자 기능을 확인할 수 있는 시스템을 확립하는 목표를 가짐
  • - Primary phenotyping과 mouse production에 대한 세계적 컨소시움을 형성
  • - 최종적으로 20,000 mutant mouse line에 대한 테스트를 함
  • - phenotyping에 대한 각 연구기관 전문가 등의 네트워크를 공고화 함
  • - 인간의 질병 연구에 있어서 마우스 모델을 이용 가능하게 확립함
  • - 데이터를 중앙에 집중화 하고 구축된 자료는 제한 없이 이용이 가능하도록 무료개방 함
  

  < 그림 2 IMPC의 비젼 >

• 주요활동
  • - IMPC는 궁극적으로 유전자 기능을 확인하는데 초점을 두고 2단계(Phase)로 사업을 구성함
  • - 데이터 이용 시 무료이용, 제한 없는 이용을 추진하고 있으며 사업을 통해 얻게 되는 지적재산권에 대한 정의는 현재 명확히 정리되어 있지는 않음
  • - Phase 1 (2011~2016) : EUMODIC 과 같은 존재하는 프로그램을 완수를 목표로 데이터를 중앙 집중화 하고 생산을 표준화 하며, 4,000개의 타겟 유전자의 표현형을 분석함
  • - Phase 2 (2016~2021) : pipeline 과 operation을 가능한 조정하고 유전체를 완성을 목표로 GEM 생산의 표준화와 16,000 개의 타겟 유전자의 표현형을 분석함

3. KOMP (Knock-Out Mouse Project) 및 KOMP2
(Knock-Out Mouse Production and Phenotyping)

• 미국국립보건원 주도의 Knockout-mouse 프로젝트는 IKMC의 일원으로 Conditional 제작 및 null KO 마우스 생산을 위해 형성된 국가주도 GEM 프로젝트임
• 국립보건원 19개 기관(Office of AIDS Research 포함)에서 주도하고 있으며, 유전자가 결손된 마우스의 배아줄기세포(ES cell, Embryonic Stem cell)를 일반 연구자에게 공급하여 연구 및 연구 지원함을 목적으로 함
• 8,500개의 유전자가 적중 파괴된 ES cell 생산, 궁극적으로 마우스 전체 유전자에 대한 Knockout ES cell 및 마우스의 생산 등을 목표를 가짐
• KOMP (knockout mouse project)는 1단계는 2011년 종료를 앞두고 프로젝트를 통해 수집된 자원을 바탕으로 한 KOMP2 (Knockout Mouse Production and Phenotyping) 프로젝트가 2011년 시작 KOMP2.
  http://nihroadmap.nih.gov/KOMP2/overview.aspx
• KOMP2는 유전자변형 마우스의 표현형 분석 기반의 신규 유전자 기능 탐색 등을 목표로 함
• 주요 활동분야로는 C57BL/6 마우스를 중심으로 reporter 유전자를 이용한 null allele의 생산, 상용화되지 못한 knockout mouse의 생산 및 공급, High throughput 생산을 위한 C57BL/6 ES cell의 공급 및 효율성 증대, Data coordination center 운용 등을 하고 있음

< 그림 3 KOMP2 프로젝트 프로세스 >

4. NorCOMM
(North American Conditional Mouse Mutagenesis project)

• 캐나다는 2004년 NorCOMM을 설립하여 GEM을 활용한 마우스의 유전자 기능 분석을 통한 신약개발과 비임상 연구를 위한 기반구축을 목표로 GEM 연구개발을 진행함
• 주요 활동분야로는 C57BL/6 마우스를 중심으로 reporter 유전자를 이용한 null allele의 생산, 상용화되지 못한 knockout mouse의 생산 및 공급, High throughput 생산을 위한 C57BL/6 ES cell의 공급 및 효율성 증대, Data coordination center 운용 등을 하고 있음
• NorCOMM의 주요 기술로는 특정 신경회로를 가시화 하거나 차단한 Gene Trapping과 특정유전자를 타겟으로 Homologous recombination을 이용한 insertional mutagenesis인 Gene Targeting이 있음
• NorCOMM은 마우스 유전자 기능해석과 국제 컨소시움 참가를 통한 바이오 경쟁력 확보를 목표로 함
• 대규모 GEM 제작, 초고속 GEM 표현형분석, GEM의 유전자 발현 분석을 통한 유전자 기능 및 네트워크 규명, GEM 보존, 유지, 생산 및 분배, GEM 정보 공유 및 데이터베이스 구축 목적을 가짐

5. EUCOMM (European Conditional Mouse Mutagenesis Program)

• EU FP5 보건의료 사업 분야의 일환으로 유럽 질환모델 마우스 개발프로그램 EUCOMM 사업이 실행되었으며, 사업 결과로 제작된 GEM 자원은 IKMC를 통해 미국, 캐나다와 공유하고 있음
• 마우스를 통한 인간 유전자 확인, 인체 모든 유전자의 GEM 제작, 제작한 GEM의 표현형분석 기반 구축, GEM을 활용한 질환모델구축을 목적을 가짐
• 5,000 종의 변이유전자 gene trap ES cell 제작, 8,000 종의 targeted ES cell 제작, 320 종의 GEM 제작, 20 종의 Cre-TG 제작, Vector, ES cell 및 GEM의 보존과 분양을 목표로 하고 있음

6. INFRAFRONTIER

• 유럽프로젝트인 인프라프론티어(INFRAFRONTIER)는 모든 마우스 유전자에 대한 마우스모델의 구축과 표현형 및 마우스저장 기반시설 구축을 목표로 함
• 인프라프론티어(INFRAFRONTIER) 내에서 두 개의 중요 서비스가 있으며 Phenomefrontier는 영상과 같은 비침습적 도구를 이용해 의료적으로 관련된 마우스 모델의 분석을 중심으로 하고 있으며 또 다른 Archivefrontier는 저장된 마우스 모델에 대한 자원을 제공하고 연구를 위해 이용될 수 있도록 지원하고 있음
• 추가적으로 germ 마우스의 생산과 표현형분석에 관한 기술 및 동결보존 기술에 관한 교육 또한 실시하고 있음
• 이러한 구조의 개발은 유럽 마우스돌연변이정보데이터(EuropeanMouse Mutant Archive : EMMA)와 같은 기존 네트워크와의 협력을 기반으로 함